A pesar de ser un peligro alimentario bien conocido, las infecciones por Salmonella spp. son una de las enfermedades gastrointestinales de mayor incidencia. El control analítico más rápido utilizado de forma general para este agente se basa en la técnica PCR. Pero presenta el inconveniente de no poder discernir si un positivo corresponde con microorganismos viables y por lo tanto con capacidad infectiva o no viables, sin esta capacidad. La técnica es rápida y los plazos habituales de los laboratorios son de 24 h. Pero en el caso de resultado positivo (en realidad presunto positivo) se requiere confirmar mediante un cultivo que alarga en tres días la obtención de resultados concluyentes.
Incidencia de la salmonelosis
Las infecciones por Salmonella spp. son una de las enfermedades gastrointestinales más comunes en la Unión Europea. Según el último informe anual del Sistema de Alerta Rápida de Seguridad de los Alimentos y Piensos de la UE (RASFF), Salmonella es el patógeno notificado con mayor frecuencia, tanto en los alimentos de los países miembros (371 notificaciones en 2019), como en los procedentes de países terceros (347 notificaciones en el mismo periodo). La carne es el producto implicado en la mayor parte de las notificaciones, en particular la carne de aves de corral, debido al criterio de seguridad alimentaria criterio de ausencia de Salmonella Typhimurium y Enteritidis para la carne fresca de aves de corral. En general, S. enteritidis y S. typhimurium son los serotipos más frecuentemente asociados a enfermedades. En EE UU se estima que se producen cada año de 2 a 4 millones de casos de salmonelosis, y en el mundo se estima que mueren 3 millones de personas por infecciones relacionadas con Salmonella spp. anualmente.
Además de las carnes, los alimentos crudos con huevo (salsas, helado, crema, masa de hojaldre), la leche sin pasteurizar, el jugo sin pasteurizar, el chocolate, o los brotes de soja o alfalfa, son alimentos en los que puede haber incidencia. Si el agua en la que viven los peces y mariscos está contaminada, también estos pueden llegar a estarlo.
Técnicas utilizadas para el control de Salmonella
La técnica utilizada tradicionalmente para la detección y cuantificación de Salmonella spp. se basa en el cultivo de el microorganismo en un medio selectivo y consta de 5 pasos básicos:
Preenriquecimiento, es este paso la muestra es enriquecida en un medio nutritivo no selectivo, que permite restaurar las células de Salmonella dañadas, logrando de esta manera una condición fisiológica estable.
Enriquecimiento selectivo, se logra a partir de un medio de cultivo que tiene que cumplir dos condiciones, incrementar las poblaciones de Salmonella e inhibir otros microorganismos presentes en la muestra.
Selección en medios sólidos, se utilizan medios selectivos, que restrinjan el crecimiento de otros géneros diferentes a Salmonella y que permitan el reconocimiento visual característico de colonias sospechosas.
Identificación bioquímica, este paso permite la identificación genérica de los cultivos de Salmonella y la eliminación de cultivos sospechosos falsos.
Serotipificación, es una técnica inmunológica (antígeno-anticuerpo) que permite la identificación específica de un microorganismo.
Como técnica alternativa a la tradicional, considerada de confirmación, se ha implantado ampliamente la qPCR. Esta técnica es una evolución de la PCR en la cual se suprime el paso de evaluación mediante electroforesis en gel. Se combina en un solo paso la amplificación de secuencias específicas de ADN del microorganismo tal como se hace en una PCR convencional con la utilización de un fluoróforo con afinidad por el ADN o sondas marcadas con fluorescencia, que permiten cuantificar las copias de ADN realizadas y de esta manera el número de células originales. Una de las ventajas más grandes que tiene esta variación de la PCR es la realización en condiciones libres de contaminación y poco o nada manipulación del operario en el caso de ser automatizado el ensayo.
Una diferencia importante entre ambas técnicas (cultivo y qPCR), es el tiempo necesario para realizar los análisis. La emisión de resultados por parte de la mayoría de los laboratorios puede llegar a realizarse en el segundo caso en plazos de 24h, mientras que el método tradicional requiere de 3 días.
Por contra la qPCR tiene el inconveniente de cuantificar material genético en la muestra originaria sin distinguir a los microorganismos viables de los no viables, por lo que los resultados son concluyentes en caso de ser negativos, pero no en el de obtenerse un resultado positivo. En este caso, para comprobar que se trata de células viables y poder dar un positivo concluyente (hasta ese momento presunto positivo) se requiere de una fase de confirmación Esta fase nos retrotrae al método tradicional y por tanto añade 3 días al plazo de emisión de resultados y convierte las 24 h en 4 días.
En el caso de alimentos perecederos esto puede significar tener que descartar o reprocesar innecesariamente los lotes de producción que resultaron positivos en la qPCR y no se confirman, con la consiguiente pérdida económica y la eventualidad de no poder cumplir con los compromisos de suministro pactados con los clientes.
Desarrollo y acreditación de una técnica de viables qPCR para Salmonella spp
Ahorrar tres días en el análisis completo de este patógeno constituye por tanto una ventaja competitiva para las empresas que tienen identificado este peligro como riesgo significativo y realizan el control de su producción de forma rutinaria, muy especialmente si tienen implantado un sistema de liberación positiva de lotes (análisis del 100% de lotes producidos y no expedición de lotes positivos).
Por ello, el desarrollo de un método que permita la confirmación de viables en la propia qPCR, es decir v-qPCR en condiciones que lo hagan competitivo constituye una mejora sustancial frente a las soluciones actuales. Pero además, dada la criticidad de la garantía de calidad de los resultados, resulta imprescindible contar con una técnica acreditada a este efecto en las matrices (productos) objeto de análisis.
La técnica que hemos desarrollado se fundamenta en el uso de agentes intercalantes del ADN. Estos agentes entran en las células muertas con pared celular dañada, se unen al ADN y no permiten su amplificación en el proceso de qPCR. Se amplifica solamente el ADN de las células viables.
En la actualidad somos el único laboratorio con este método acreditado para el análisis de Salmonella spp. en productos cárnicos, desde productos frescos a productos procesados (pollo asado, carne picada, embutidos, curados, mortadela, etc.).
Fuente: Eurocarne Digital
